免疫组化技术是当今广泛应用的检测组织切片内特定蛋白的实验手段。利用图像分析软件来判读切片图像上蛋白表达程度是随着软件技术的发展逐步应用到免疫组化技术中的。
组织上的蛋白表达程度，在图片上表现为免疫染色的深浅及面积大小。用肉眼只能定性地进行判读，较多粗略地作一个主观的分级评价。使用图像分析软件则可以对图片染色的程度作一个定量的测量。这个测量结果与切片上的蛋白表达强度有理论上的线性相关性。所以能客观定量地反映它。
在图像分析的方法中，使用灰度来表示一个点的明暗程度，而图片上一个点的明暗程度是与切片上免疫染色物的“光学密度（OD，Optical Density ）”决定的，再往下追踪一步，就是与组织切片上这个点的蛋白表达程度决定的。这有点类似于分光光度计的情形，比色皿里液体样品的吸光度与液体中吸光成分的浓度相关，符合朗伯-比尔定律。图片上一个点的光密度则与该点上的蛋白表达程度正相关（近似为正比）。所以测量一个点的光密度值，就是在测量这个点上蛋白表达程度的一个相对的量值。
朗伯-比尔定律：
A为吸光度,T为透射比,是投射光强度比上入射光强度
c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度
请注意：郎伯比尔定律中的指数关系表现在吸光度A与透射率T之间。吸光度A就是光密度OD。它与样品浓度是线性关系。所以图片上光密度值与蛋白表达之间的关系理论上也是线性的。但它与灰度值之间的关系是指数的。因此，测量光密度值能更紧密地与蛋白表达程度相关，而灰度值则类似于透光率，它与蛋白表达程度的关系是朗伯比尔定律的反向的指数关系。这就是我一再强调要测量光密度值的原因。
在分光光度法中，我们需要作标准曲线来定量分析样品的实际浓度，但在组织切片的情形下，是没法作标准曲线的。所以我们只能测量到一个相对值。能对不同点的蛋白表达程度进行比较，但不能测量到这个点的蛋白量具体是多少微克。把一片区域内所有的点的光密度值累加起来，就得到一个积分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 图片上一片片的染色斑块的深浅与范围反映了切片上的特定蛋白表达的程度，它可以由图片上的积分光密度来相对定量地来表示。
无论使用什么图像分析软件，测量原理都是一样的。就是测量图片上一个区域内的黄色染色物的积分光密度。但是具体测量哪些区域的积分光密度以及较后要如何作统计分析，就不是一个简单的图像分析问题了，而是与研究目标密切关联的实验设计问题。这也就是我无法说出该选择什么样的测量区域来计算区域面积与区域内光密度值的原因。我只能总结出一个规律，就是要计算一个平均光密度指标来进行实验组样品与对照组样品的统计比较。也就是计算出测量区域内的积分光密度值，然后对这个区域的面积进行平均。以这个平均光密度值作为统计比较的依据。
示例：根据实验设计选择的测量指标：
直接比较整张图片的积分光密度值。实际上测量面积就是整张图片的面积。
比较特定区域的平均光密度值。在一张图片上有许多区域的时候，可以只抽取其中部分试样来测量的。这影响到的是抽样量。当然，应当尽可能地测量图片上全部应当测量的区域。
同一张图片上不同的区域之间进行比较。这时候一张图片上能得到一对数据，全部样品测量数据可以作配对T-检验。
测量图片上一个特定区域内的平均光密度。注意选择测量区域的时候，选得不太准不要紧，这仍然是个抽样的问题，它对平均光密度值的影响是很小的。
测量区域就是染上了颜色的细胞，此时在测量黄色的IOD值的时候能同时测量出面积来。不必另外去选择测量区域。根据实验设计可以有多种测量指标供选择：每个细胞的面积，积分光密度，平均光密度，照片上的细胞数量（其实就是细胞密度）等等。
在整个分析过程中，一般每张图片测量出的只是一个平均光密度值，作为一个测量数据。一张切片则需要拍摄多张照片，这些照片各自的光密度平均值平均之后可以作为这张切片的测量数值。一个实验样品又可能会制作多张切片，所以较终一个样品（一块组织，一个动物，一个病例等）的测量数据就是所有这些照片的平均光密度值的平均值。在两组实验样品的统计处理中，就是把每个实验样品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作为该样品的测量数值。一组样品的测量值再计算其平均值与标准差进行统计分析。对细胞核上蛋白的免疫组化测量有其特殊性。如果蛋白只在细胞核上表达，则不需要对核作蓝染，切片上只有细胞核上有黄色染色物。可以直接进行分析测量。
在更多的情况下，对细胞进行蓝染是必须的。只有染上蓝色才能判断细胞核的区域。但同时，蓝染对细胞核的光密度测量造成了严重干扰。会导致光密度测量值的极大误差。这时候用肉眼主观判断与图像分析测量的结果基本上没啥区别了。一个主观的定量方法就是用肉眼判断阳性细胞核与阴性细胞核，然后计数其比例作为一个定量的测量值。但这只适用于切片上有两类细胞的情况。测量细胞核上的免疫组化图片需要从染色开始就要考虑其分析测量过程。过程会比较复杂。这也相当于一个实验方法的研究课题了。
关于使用荧光染料染色的荧光照片，使用图像分析方法测量其荧光强度是不被提倡的。这并不是因为图像分析软件测量不了图片的光密度，而是因为在荧光图片的拍摄过程中，完全不能把切片的荧光强度正确地表现到图片的光密度上。较终的定量分析结果恐怕还不如镜下目视的判断结果准确。
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